Các hợp chất huỳnh quang có một dải bước sóng đặc hiệu mà tại đó nó sẽ hấp thụ năng lượng ánh sáng. Sự hấp thụ ánh sáng khiến electron từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích, sau một thời gian ngắn electron kích thích sẽ quay trở lại trạng thái cơ bản và phát ra năng lượng dưới dạng photon ánh sáng. Sự chuyển năng lượng này được gọi là huỳnh quang.
Hình 3: Cơ chế tạo huỳnh quang.
Các chất huỳnh quang được sử dụng trong kỹ thuật flow cytometry được phân thành nhiều nhóm bao gồm chất huỳnh quang cho đánh dấu protein và chất huỳnh quang cho acid nucleic và các phân tử báo cáo.
Để có thể đánh dấu protein, phải sử dụng đầu dò là các kháng thể được đánh dấu huỳnh quang, tuy nhiên các protein khác như lectin, hormone, avidin hoặc streptavidine có thể được đánh dấu trực tiếp với nhiều chất huỳnh quang. Các chất huỳnh quang thông thường được sử dụng để đánh dấu kháng thể là FITC, phycoerythrin (PE) và allophycocyanin (APC). Việc chọn lọc chất huỳnh quang thích hợp là rất quan trọng và phụ thuộc và nguồn laze sử dụng. Nếu như nguồn argon laze được sử dụng trong flow cytometry, thì chất huỳnh quang tốt nhất nên sử dụng là FITC, thứ hai là PE.
FITC dễ dàng phản ứng với nhóm amino của lysine trên protein và tạo ra được sự liên kết một cách ổn định vừa phải. FITC (có bước sóng kích thích/ huỳnh quang xấp xỉ 495/520 nm) là một chất huỳnh quang tốt cho việc nhuộm đơn màu bởi vì độ hấp thụ tối đa là gần 490 nm. Mặt khác, sự phát ra bước sóng dài hơn khiến FITC không phù hợp với các ứng dụng đa màu. Hơn nữa, tính huỳnh quang của nó nhạy với pH và có thể bị mất khả năng huỳnh quang (photobleaching) khi tỉ lệ cao. Để giải quyết vấn đề này, nhiều dẫn xuất của FITC đã được phát triển như AlexaTM với độ ổn định quang cao và tăng khả năng phát huỳnh quang.
PE (có bước sóng kích thích/huỳnh quang: 495,565/578 nm) và APC (có bước sóng kích thích/ huỳnh quang: 650/660 nm) hay còn được gọi là phycobiliproteins- một thành phần của hệ thống quang hợp. Chúng có độ hấp thụ ánh sáng tốt và cường độ huỳnh quang cao. Mặc dù khả năng phát huỳnh quang của chúng là gấp 30 lần so với các chất huỳnh quang nhưng trong thực tế thì các tế bào được đánh dấu với kháng thể phycobiliprotein chỉ có cường độ huỳnh quang cao hơn khoảng 5-10 lần so với khi được đánh dấu với FITC. Với FITC và PE, có thể sử dụng đèn argon laze để kích thích nhưng việc kích thích APC lại cần đèn helium-neon laze do nó hấp thụ ở bước sóng cao hơn (650 nm). Nhược điểm chính của phycobiliproteins là khối lượng phân tử cao do đó sẽ gây ra các thay đổi ở gốc steric khi liên kết với protein. Chúng cũng có thể gây ra tín hiệu nhiễu cao nếu như tế bào không được rửa thích hợp.
Gần đây, bên cạnh các chất huỳnh quang, sự phát triển các dye tandem, gồm hai chất phát huỳnh quang đã tăng lên. Ví dụ như sự kết hợp giữa PE và APC với nhiều loại dye cyanine tạo ra PE-Cy5 and APC-Cy7. Trong các dye tandem, khi dye đầu tiên được kích thích và hấp thụ cực đại, nó sẽ chuyển toàn bộ năng lượng cho dye thứ hai nằm ở gần đó. Kết quả là chất huỳnh quang thứ hai sẽ được hoạt hóa và phát ra ánh sáng huỳnh quang. Quá trình này được gọi là Huỳnh quang cộng hưởng năng lượng (FRET). Đây là một cách tốt để giúp tăng số lượng màu được phân tích mà chỉ sử dụng một bước sóng laze đơn.
Các chất huỳnh quang được sử dụng trong nhuộm acid nucleic trong kỹ thuật flow cytomertry có một vài ứng dụng chính như định lượng DNA, đánh giá sự nguyên vẹn của màng tế bào, kiểm tra sự đa bội và phân tích chu trình tế bào. Hiện tại, có rất nhiều dye có thể được sử dụng để nhuộm RNA và DNA như ethidium bromide (EB) và propidium iodide (PI). Một điều cần lưu ý là phải loại bỏ RNA sử dụng RNase khi định lượng DNA. EB và PI đều là chất cài xen vào giữa các bazo trong sợi đôi acid nucleic. Trong đó, PI được kích thích bởi ánh sáng xanh da trời và phát huỳnh quang ánh sáng đỏ; có thể được sử dụng kết hợp với FITC để định lượng đồng thời việc gắn của kháng thể và thành phần DNA khi được kích thích bởi đèn argon laze ở bước sóng 488 nm. 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) lại là một chất huỳnh quang khác có đặc tính bám vào vùng giàu GC trên DNA và chỉ được sử dụng để nhuộm tế bào chết do không đi qua được màng của tế bào sống. Nó có thể được kích thích bởi nguồn sáng là argon laze và được sử dụng với kháng thể đánh dấu FITC và PE. Ngoài ra, còn có nhiều dye khác được kích thích bởi ánh sáng UV như Hoechst và DAPI (gắn vào vùng giàu AT của DNA).
Bên cạnh đó, các phân tử báo cáo cũng được sử dụng trong phân tích flow cytometry. Ví dụ, protein GFP (green fluorescent protein) được kích thích ở bước sóng 488 nm và phát ra huỳnh quang xanh lá cây. GFP và các dạng đột biến của nó được sử dụng trong rất nhiều ứng dụng như sàng lọc các tế bào được chuyển nhiễm GFP. Một phân tử báo cáo khác là dye JC-1 được sử dụng để đo tiềm năng màng ty thể. Vì JC-1 tích lũy trong ty thể ở tế bào khỏe mạnh bằng việc hình thành cụm JC-1 màu đỏ, phát ra bước sóng là 590 nm.
3. Phát hiện tín hiệu và xử lý
Các tín hiệu ánh sáng được tạo ra bởi các hạt đi qua chùm tia laze trong một dòng dung dịch và sau đó được chuyển thành điện thế nhờ photodetector. Có hai loại detector là photodiode (PDs) và photomultiplier tubes (PMTs) thường được sử dụng do có độ nhạy cao. Thêm vào đó, photocathode của PMT có độ nhạy cao hơn so với PD mặc dù PD được biết đến là có khả năng chuyển ánh sáng thành photoelectron hiệu quả hơn. PD có khả năng phát hiện các tín hiệu ánh sáng mạnh hơn được tạo ra bởi FSC, trong đó PMTs thường được sử dụng để phát hiện các tín hiệu yếu hơn được tạo ra bởi SSC và ánh sáng huỳnh quang.
Các tín hiệu ánh sáng bị bắt giữ bởi PMT hoặc PD được chuyển thành số lượng các electron để tạo ra dòng điện. Dòng điện được chuyển đến bộ phận khuếch đại và được chuyển thành xung điện thế. Lượng tối đa ánh sáng tán xạ và huỳnh quang sẽ thu được khi hạt nằm ở trung tâm của chùm tia, khi hạt ra khỏi chùm tia, xung điện sẽ quay trở lại đường nền.
Hình 4: Xử lý và phát hiện tín hiệu. Các thành phần của máy flow cytometer.
Aysun Adan, Günel Alizada, Yağmur Kiraz, Yusuf Baran and Ayten Nalbant (2015), “Flow cytometry: basic principles and applications”, Critical Reviews in Biotechnology, 37(2), pp. 163–176.
Lược dịch Biomedia Việt Nam
