Tổng quan
Flow
cytometry là kỹ thuật có khả năng đo được các đặc tính huỳnh quang và quang học
của một tế bào đơn hoặc các hạt như vi sinh vật, nhân và nhiễm sắc thể được chuẩn
bị trong dung dịch lỏng khi chúng đi qua một nguồn sáng. Các máy flow cytometry
đầu tiên là một thiết bị đơn thông số (single-parameter) chỉ được sử dụng để
phát hiện kích thước của tế bào. Hiện nay, các thiết bị với độ phức tạp cao có
khả năng phát hiện đồng thời 14 thông số đang được phát triển. Nguyên tắc cơ bản
của kỹ thuật này liên quan tới ánh sáng tán xạ và ánh sáng huỳnh quang phát ra,
được tạo ra do nguồn sáng kích thích (thường là chùm tia laze). Các thông số
thu được có thể là thông tin giá trị về các khía cạnh hóa sinh, sinh lý và phân
tử của hạt. Ánh sáng tán xạ trong kỹ thuật có liên quan trực tiếp tới các đặc
điểm cấu trúc và hình thái học của tế bào, trong khi đó, ánh sáng huỳnh quang
có nguồn gốc từ các đầu dò đánh dấu huỳnh quang, tỉ lệ thuận với lượng đầu dò
huỳnh quang gắn vào tế bào và các thành phần trong tế bào. Có hai loại flow
cytometry khác nhau là non-sorting (không phân loại) và sorting (phân loại).
FASC (Flourescent activated cell sorters) là các máy đếm tế bào theo dòng chảy
có khả năng phân loại các thế bào được đánh dấu huỳnh quang từ một hỗn hợp các
quần thể tế bào.
Đầu tiên, các hạt sẽ được đưa tới đèn laze trong một
dòng chất lỏng. Bất kỳ hạt hòa tan hoặc tế bào nào có kích thước từ 0.2-150 µm
đều phù hợp; các tế bào từ các mô rắn phải được loại bỏ trước khi phân tích.
Khi các hạt đi qua tia laze, chúng tán xạ ánh sáng laze, ánh sáng tán xạ và ánh
sáng huỳnh quang sẽ được thu tại thấu kính tại vị trí thích hợp. Sự kết hợp giữa
bộ phận tách chùm tia và các kính lọc sẽ hướng ánh sáng tán xạ và ánh sáng huỳnh
quang tới detector; cuối cùng các detector sẽ tạo ra tín hiệu điện tỉ lệ thuận
với tín hiệu quang học.
Các
thành phần chính của máy flow cytometer (đếm tế bào theo dòng chảy) và cell
sorter (phân loại tế bào) bao gồm: hệ dung dịch, hệ thống quang học (ánh sáng
kích thích và bộ thu ánh sáng kích thích), mạng lưới điện (detector) và một máy
tính. Hệ thống dung dịch có trách nhiệm điều hướng dòng dung dịch chứa các hạt
tới nguồn sáng. Hệ thống quang học kích thích sẽ tập trung nguồn sáng tới các tế
bào/ các hạt, còn hệ thống quang học thu nhận sẽ chuyển các ánh sáng tán xạ hoặc
ánh sáng huỳnh quang tới mạng lưới điện tử. Mạng lưới điện sẽ phát hiện tín hiệu
và chuyển các tín hiệu thành các thông tin số tỉ lệ thuận với cường độ ánh sáng
và máy tính sẽ phân tích các thông tin này.
Kỹ
thuật flow cytometry được sử dụng rộng rãi trong nhiều ứng dụng nhằm phát hiện
các kháng nguyên màng, tế bào chất và nhân. Ngoài ra, toàn bộ tế bào và các thành
phần tế bào như bào quan, nhân, DNA, RNA, nhiễm sắc thể, cytokines, hormone và
protein có thể được phát hiện thông qua kỹ thuật này. Việc phân tích các quá
trình trong tế bào và chu trình tế bào nhờ việc đo lượng calcium và điện thế
màng cũng là một trong các ứng dụng của flow cytometry. Bài viết dưới đây sẽ
trình bày kỹ hơn về các thành phần của một máy flow cytometry.
1. Hệ
thống dung dịch
Hệ
thống dung dịch có vai trò vận chuyển các tế bào trong một dung dịch đi qua thiết
bị để thu được các dữ liệu, hệ thống này bao gồm 2 thành phần: sheath fluid (dòng
dung dịch bảo vệ/ dòng dung dịch bên ngoài) và pressurized line (dòng áp suất).
Sheath fluid là một dung dịch pha loãng (thông thường là đệm PBS- phosphate-buffered
saline), được tiêm vào buồng flow nằm tại trung tâm của thiết bị bởi dòng áp suất.
Một áp suất không khí cũng được tiêm vào các tế bào đã được hòa tan trong ống mẫu
vào bên trong buồng flow. Dòng mẫu sẽ được đưa vào lõi trung tâm mà xung quang
là dòng dung dịch bảo vệ và trở thành dòng lõi (core fluid- một dòng rất hẹp chỉ
để từng tế bào hoặc từng hạt đi qua), được tạo ra dựa trên sự khác biệt áp suất
giữa dòng dung dịch bên ngoài (sheath fluid) và dòng mẫu (sample fluid), từ đó
giúp tập trung tế bào/hạt có trong mẫu thành dòng tế bào đơn để đi qua chùm tia
laze. Do đó, quá trình này cho phép chiếu sáng đồng đều mỗi tế bào nên được gọi
là quá trình tập trung thủy động lực học (hydrodynamic focusing).
Hình 1: Nguyên tắc hoạt động cơ bản
của kỹ thuật flow cytometry.
Tỷ
lệ đưa các tế bào vào chùm tia laze có thể được thực hiện nhờ hệ thống máy flow
cytometer dựa trên mục đích của phân tích. Ví dụ, tỉ lệ dòng chảy cao thường sử
dụng cho việc đo lường như immunophenotyping ở tế bào động vật có vú, trong khi
đó, tỉ lệ dòng chảy thấp thường thích hợp với các ứng dụng yêu cầu độ phân giải
cao như phân tích thành phần DNA. Các thông số quan trọng cần thiết thu được nhờ
sự tiếp xúc các hạt với chùm tia laze phụ thuộc vào hoạt động tối ưu của các hệ
thống dung dịch. Do đó, cần phải đảm bảo rằng không có bong bóng khí và các mảnh
vụn trong hệ thống này để áp lực sẽ đồng đều ở mọi thời gian.
2. Hệ
thống quang học
Hệ
thống quang học trong máy flow cytometry làm nhiệm vụ chiếu ánh sáng kích thích
bao gồm đèn laze, thấu kính và bộ phận thu ánh sáng. Thấu kính có vai trò định
hình và tập trung chùm tia laze. Ánh sáng laze được tạo ra bằng cách kích thích
các điện tử (electron) đang ở trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích có mức
năng lượng cao nhờ điện áp, sau một thời gian ngắn (thường là 10-7 –
10-8 giây), các điện tử sẽ trở về trạng thái cơ bản và phát ra năng
lượng dưới dạng các photon ánh sáng. Sau khi laze chiếu vào tế bào, những ánh
sáng bị chệch hướng so với đường tryền thẳng do gặp phải vật cản được gọi là
ánh sáng tán xạ. Có hai loại ánh sáng tán xạ là forward scatter (FSC) và side
scatter (SSC). Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tán xạ ánh sáng là màng tế bào,
nhân, các hạt của tế bào, hình dạng và bề mặt tế bào. Nhìn chung kích thước của
tế bào hoặc của một hạt và độ phức tạp bên trong tế bào được đặc hiệu bởi loại
tán xạ. Ánh sáng FSC là kết quả của sự nhiễu xạ thu được dọc theo trục của chùm
tia tới laze. FSC tỉ lệ với diện tích bề mặt hoặc kích thước tế bào và phù hợp
để phát hiện, phân biệt các hạt về kích thước, thường sử dụng phổ biến trong
immuophenotyping. Còn ánh sáng SSC bao gồm hầu hết các ánh sáng khúc xạ và nhiễu
xạ, được thu ở góc 90o so với chùm tia tới laze. SSC tỉ lệ với thành
phần các hạt hoặc độ phức tạp bên trong tế bào. Bên cạnh đó, ánh sáng huỳnh
quang có nguồn gốc từ kháng thể hoặc dye đánh dấu huỳnh quang như là PI cũng được
phản xạ tại cùng một góc với SSC.
Hình 2: Ánh sáng tán xạ (light
scattering). FSC tỉ lệ với kích thước, trong khi đó SSC tỉ lệ với các thành phần
và độ phức tạp bên trong tế bào.
Có
rất nhiều cấu hình laze trong máy flow cytometer dựa trên loại chất huỳnh quang
được kích thích. Đèn argon laze (một đèn laze thông thường với bước sóng kích
thích 488 nm) được sử dụng để kích thích nhiều dye tổng hợp như fluorescein
isothiocyanate (FITC) và dye huỳnh quang tự nhiên như tảo và phytoplankton. Rất
nhiều máy flow cytometer và sorter có thêm đèn laze có khả năng kích thích chất
huỳnh quang ở bước sóng kích thích ở dải sóng UV (300-400nm) hoặc red diode
kích thích chất huỳnh quang ở dải sóng đỏ (630 nm).
Hệ
thống thu nhận ánh sáng gồm thấu kính để thu ánh sáng phát ra từ sự tương tác
giữa chùm tia laze và hạt; một hệ thống gương và kính lọc để tách và sau đó hướng
ánh sáng có bước sóng đặc hiệu đến detector thích hợp.
Xem tiếp PHẦN 2: Kỹ thuật Flow cytometry - Phần 2
