Tính nhất quán là chìa khóa
Mỗi bước của thí nghiệm, từ việc thiết lập quy trình đến việc thu mẫu, xử lý mẫu, chạy phân tích đều yêu cầu rất nhiều bước nhỏ, và tất cả các bước trong đó đều có thể là nguyên nhân dẫn đến sự bất ổn định. Xem xét một cách toàn diện toàn bộ thí nghiệm thì tính nhất quán chính là chìa khóa để giúp giảm thiểu biến đổi. Khi lặp lại thí nghiệm, việc tiến hành mọi thứ chính xác y như lần đầu là rất quan trọng. Điều đó không có nghĩa là bạn cần phải mặc y hệt một chiếc áo blouse hay bật y hệt bài hát khi lặp lại thí nghiệm, mà nghĩa là bạn cần ghi chú kỹ các bước vào trong một cuốn sổ thí nghiệm về các thông số như bao nhiêu microgram protein ly giải sử dụng trong tổng số bao nhiêu thể tích PBS khi thực hiện phương pháp tủa hóa mô miễn dịch. Sẽ không thể biết được từng chi tiết của sự khác biệt, nhưng phải luôn giả định rằng bất cứ thứ gì cũng đều có khả năng làm ảnh hưởng đến kết quả của bạn, điều này sẽ giúp bạn làm việc thống nhất, giảm thiểu sự biến thiên và đạt được độ ổn định cao.
Mọi thứ luôn luôn thay đổi: đó là lý do tại sao sự nhất quán, kiên định lại không dễ thực hiện
Rất khó khăn để kiểm soát các biến đổi vì bản chất tự nhiên của chúng là luôn luôn thay đổi. Ví dụ như sự oxi hóa – nó luôn luôn diễn ra, nên nếu bạn không có buồng kín chứa môi trường chân không thì hãy cẩn thận. Nếu như bạn đang xử lý tế bào với một dung dịch đã được chuẩn bị từ trước bằng cách trộn hòa stock với nước, thì việc sử dụng cùng một dung dịch mà bạn đã pha từ lần làm trước nghe thì có vẻ nhất quán nhưng đo quá trình oxy hóa nên có thể dung dịch đó không còn được như cũ nữa, do đó, mỗi lần làm cần phải pha tươi dung dịch này.
Hay bạn đã bao giờ để một ống nước trong tủ lạnh hay trên bàn thí nghiệm trong một thời gian dài chưa? Khi đó bạn sẽ thấy các giọt nước nhỏ đọng trên thành ống, đó là bởi vì vũ trụ liên tục chuyển động và mọi phân tử cũng như vậy. Chúng ta sử dụng các tủ -20oC và -80oC để làm chậm mọi thứ lại nhưng vẫn còn có thể có sự lắng đọng rất nhỏ, cỡ nano. Bản thân là một nhà khoa học, bạn đang phải liên tục chiến đấu với sự chuyển động vĩnh cửu của vũ trụ, nên nếu càng kiên định, nhất quán và kiểm soát tốt việc này, kết quả của bạn sẽ càng chính xác và lặp lại tốt hơn.
Để làm tốt khoa học là cực kỳ khó khăn bởi vì giảm thiểu các biến đổi có nghĩa là bạn luôn phải để ý, như kiểu bị ám ảnh (OCD-rối nhiễu ám ảnh cưỡng chế). Tuy nhiên, khi đã quen, nó sẽ tạo ra một thế giới khác biệt và bạn sẽ có được nhiều số liệu tốt để đăng báo. Dưới đây là một danh sách ngắn giúp bạn bắt đầu suy nghĩ nhằm giảm thiểu sự biến đổi. Hãy sử dụng nó để bổ sung thêm kiến thức, kinh nghiệm trong phòng thí nghiệm và mỗi khi lặp lại các thí nghiệm, phải luôn luôn nhớ rằng tính nhất quán là chìa khóa.
1. Các thành phần có thể được tái sử dụng với các thành phần cần pha tươi
Cùng nói về việc tách ARN, sau khi tách xong, bạn đã sử dụng một lượng nhỏ để phiên mã ngược thành cDNA, làm đông phần còn lại và sử dụng toàn bộ cDNA đó cho q-PCR. Hiện tại, bạn muốn lặp lại lần chạy q-PCR đó nên bạn sẽ lấy ARN đã bảo quản đông ra. Điều này có thể ảnh hưởng đến lần thí nghiệm sau của bạn, vì ở lần đầu, bạn tạo cDNA từ ARN tươi, mới tách xong, còn sau khi đông và rã đông thì ARN trông có vẻ vẫn bình thường nhưng về mặt phân tử có thể nó đã bị thay đổi. Do đó, việc lặp đi lặp lại thí nghiệm từ đầu đến cuối, thực hiện từng bước như đã làm ở lần đầu tiên thì nghe có vẻ sẽ mất công hơn, nhưng lại giúp bạn tiết kiệm đáng kể thời gian và các mối lo lắng sau này.
2. Ly tâm
Tốc độ và thời gian ly tâm có thể ảnh hưởng đến lượng sản phẩm cuối cùng mà bạn thu được, từ đó có thể ảnh hưởng tới các thí nghiệm sau do sự thay đổi về nồng độ các chất phản ứng. Hãy đảm bảo rằng bạn ly tâm ở cùng tốc độ và nhớ là rpm không tương đương với rcf nên hãy chắc chắn là bạn đã tính toán đúng tốc độ ly tâm khi lặp lại thí nghiệm.
3. Thể tích, nồng độ
Luôn giữ thể tích và nồng độ giống nhau ở các lần lặp lại.
4. Thời gian ủ
3 tiếng so với 2 tiếng đã là một sự khác biệt lớn, về toán học, việc thêm 50% thời gian sẽ giúp các phân tử nằm trong dung dịch có thêm các tương tác với nhau. Do đó, luôn tuân thủ thời gian ủ ở các bước thí nghiệm giữa các lần lặp lại.
5. Rửa
Số lần và thời gian rửa cũng cần phải nhất quán. Nếu rửa không đủ có thể làm giảm độ đặc hiệu và dẫn tới các số liệu không chính xác, trong khi rửa quá nhiều có thể làm mất mẫu.
6. Tỉ lệ
Ví dụ trong việc tách dòng phân tử, tỉ lệ đoạn chèn: vector trong quá trình ligate là rất quan trọng và cần tối ưu. Vì vậy, nếu bạn đã tìm thấy tỉ lệ phù hợp, hãy luôn tuân thủ nó.
7. Các sản phẩm giống nhau nhưng từ các công ty cung cấp khác nhau
Có nhiều hãng sản xuất khác nhau nhưng bán các sản phẩm giống nhau, tuy nhiên chúng có thể vẫn có những điểm khác biệt nhỏ mà có thể ảnh hưởng tới số liệu của bạn. Ví dụ, một kit tổng hợp cDNA sử dụng cặp mồi ngẫu nhiên trong khi kit khác có thể sử dụng hỗn hợp oligo dT và mồi ngẫu nhiên. Cả hai đều tổng hợp cDNA nhưng sự khác biệt này có thể ảnh hưởng đáng kể đến kết quả của bạn sau này. Nếu bạn cần phải thay đổi sản phẩm đang sử dụng thì hãy xem xét kỹ hóa chất, độ tinh khiết,.. giữa các sản phẩm để đảm bảo việc thay đổi không tạo ra bất kỳ sự biến đổi nào.
8. Nhiệt độ
Nhiệt độ phòng là một thông số không chính xác và có thể thay đổi đột ngột ngày này qua ngày khác tùy thuộc vào mùa, hoặc tùy thuộc vào thời gian trong ngày. Do đó, thay vì ủ ở nhiệt độ phòng thì nên ủ ở một nhiệt độ cố định trong bể ổn nhiệt hoặc block nhiệt.
9. Thiết bị
Mặc dù các máy PCR của bạn đều thực hiện được PCR, nhưng có lẽ chúng không phải luôn vận hành như nhau và có thể được sản xuất ở những thời điểm khác nhau. Đây là những yếu tố có thể làm thay đổi hiệu quả của máy móc. Do đó việc sử dụng thống nhất cùng một máy khi lặp lại thí nghiệm sẽ giúp kiểm soát tốt hơn kết quả.
10. Thao tác
Một trong những sự biến động thường xuyên xảy ra là việc xử lý quá nhiều mẫu cùng lúc. Nó không chỉ ảnh hưởng tới các kết quả của các thí nghiệm độc lập mà còn ảnh hưởng đến kết quả giữa các mẫu trong thí nghiệm, nên do vậy thay vì cố gắng làm thật nhiều mẫu cùng lúc mà hãy nghỉ ngơi và thao tác với số mẫu ít hơn. Điều này có thể khiến bạn mất nhiều thời gian hơn nhưng sẽ giúp bạn tiết kiệm nhiều thời gian trong tương lai vì giúp tránh được việc phải lặp lại một thí nghiệm thất bại.
Nguồn:
Ali Seyedali, “How to Minimize Variation and Achieve Reproducibility”, Bitesizebio.
