1. Nguyên tắc hoạt động
Tương tự như điện di thông thường, DNA sẽ bị kéo trên gel PFGE do lực điện. Về nguyên tắc, thành phần của thiết bị tương tự như bộ điện di thông thường gồm điện cực cho phép lực điện đi qua buồng điện di. Tuy nhiên, trong PFGE, các điện cực này được phân bố xung quanh bản gel và không phải tất cả đều được hoạt động cùng một lúc mà chỉ một số điện cực được kích hoạt cho phép dòng điện biến thiên ở một tần số góc cụ thể. Trong khi điện di thông thường chỉ mất vài giờ thì PFGE có thể mất vài ngày. Để giữ nhiệt độ của đệm không bị tăng quá cao trong khi điện di, thì đệm sẽ được đưa qua qua thiết bị làm mát trước khi được đưa trở lại buồng điện di.
Một ví dụ về thiết bị điện di trường xung đẩy.
Sự sắp xếp các điện cực trong PFGE cho phép phân tách được các phân tử DNA kích thước lớn, thậm chỉ cả nhiễm sắc thể nguyên vẹn cũng có thể được phân tách. Khi tần số góc của dòng điện thay đổi, DNA sẽ di chuyển từ phía này sang phía khác, cho phép các đoạn có kích thước lớn di chuyển được trên gel.
Ví dụ về một chu kỳ PFGE duy nhất, mũi tên chỉ ra điện cực nào được hoạt động trong chu kỳ xung nhất định. DNA được kéo theo các góc khác nhau trong suốt chương trình, và kết quả là DNA di chuyển từ từ về xuống phía dưới của bản gel.
2. Tối ưu hóa quy trình PFGE
Một quy trình PFGE không đơn giản chỉ là cài đặt hiệu điện thế, mà thiết bị PFGE cho phép người sử dụng có thể điều chỉnh một loạt các điều kiện khác như góc xung (pulse angle) và nhiệt độ của đệm. Việc tối ưu này cho phép chương trình chạy phù hợp với từng loại mẫu nghiên cứu. Các mẫu có kích thước cực lớn (>MB) sẽ có điều kiện chạy khác với các mẫu kích thước nhỏ hơn.
Dưới đây là các điều kiện cần phải tối ưu để có được kết quả tốt nhất:
+ Hiệu điện thế: Hiệu điện thế trong PFGE có đơn vị là V/cm, hầu hết các quy trình đều sử dụng 6 V/cm cho phép phân tách tốt mẫu có kích thước khoảng vài trăm kb. Nếu như mẫu có kích thước lớn hơn (megabase) thì nên sử dụng hiệu điện thế thấp hơn và ngược lại.
+ Góc xung (Pulse angle): là độ chênh lệch giữa cường độ dòng điện được sử dụng. Hầu hết các quy trình đều sử dụng góc là 120o, tuy nhiên, giá trị này có thể được điều chỉnh. Ví dụ , sử dụng một góc nhỏ hơn sẽ giúp tăng độ phân giải của các đoạn có kích thước lớn và góc lớn hơn cho đoạn có kích thước nhỏ. Dù vậy, cần lưu ý rằng, việc tăng độ phân giải của một nhóm các đoạn thường đi kèm với giảm độ phân giải của nhóm còn lại.
+ Thời gian chuyển đổi (Switch time): là nhân tố ảnh hưởng lớn nhất tới độ phân giải của mẫu. Thời gian chuyển đổi thể hiện khoảng thời gian mà dòng điện được kéo về một hướng. Sử dụng thời gian này ngắn cho các đoạn có kích thước nhỏ và dài cho các đoạn có kích thước lớn hơn. Vì nhiều mẫu sẽ chứa một loạt các đoạn DNA có kích thước khác nhau nên để giải quyết vấn đề này, cần thiết lập chương trình để thay đổi thời gian chuyển đổi trong suốt quá trình chạy. Chương trình sẽ tăng thời gian chuyển đổi từ một thời gian ngắn lên một thời gian dài hơn trong quá trình chạy để phù hợp với các kích thước khác nhau trong mẫu.
+ Nhiệt độ: Do DNA không di chuyển theo đường thẳng trong khi chạy do đó sẽ mất nhiều thời gian hơn khi điện di trường xung đẩy để DNA di chuyển hết qua gel. Và kết quả là, một lần chạy PFGE có thể kéo dài qua đêm hoặc đôi khi lên tới vài ngày. Thời gian chạy lâu như vậy cũng đồng nghĩa với việc nhiệt độ của đệm phải được duy trì để không bị quá nóng. Do đó, cần bơm đệm điện di qua các thiết bị làm mát trong quá trình chạy. Ngoài ra, đôi khi bạn cũng phải dừng quá trình chạy để thêm đệm mới nếu như đệm bị hết.
Thời gian chạy cũng phụ thuộc vào nhiệt độ của đệm. Nhiệt độ thấp đồng nghĩa với thời gian chạy lâu nhưng thường cho độ phân giải tốt hơn. Ngược lại, nhiệt độ cao sẽ cho thời gian chạy ngắn nhưng độ phân giải thấp hơn.
3. Một vài lời khuyên cho quá trình điện di trường xung đẩy
+ Cần thao tác nhẹ nhàng với mẫu DNA: DNA càng lớn thì càng dễ bị đứt gãy, do đó, bạn phải cực kỳ cẩn thận khi thao tác với mẫu sử dụng trong điện di trường xung đẩy.
Cách dễ dàng nhất để giải quyết vấn đề này là tách DNA trong một hộp agarose vì thông thường khi DNA được ngâm, nhúng thì sẽ ít bị tác động của các lực làm đứt gãy hơn. Một quy trình chung đó là hòa tan các tế bào trong agarose nóng chảy và hút agarose cùng hỗn hợp tế bào vào một khuôn đổ gel trước khi tách DNA. Việc tách sẽ yêu cầu một loạt các bước rửa để loại bỏ các mảnh tế bào sau đó là các bước thủy phân bằng enzyme, cuối cùng là nạp mẫu lên gel điện di trường xung đẩy.
Nếu như DNA ở dạng lỏng thì càng phải cẩn thận hơn. Tránh vortex DNA và cần phải thật nhẹ nhàng.
Nguồn: http://www.applied-maths.com
+ Lựa chọn agarose một cách thông minh: Nếu sử dụng agarose thông thường cho điện di thì chất lượng thu được thường khá kém, DNA vẫn di chuyển được trong gel nhưng các băng thường bị nhiễu hơn, do đó khá khó khăn khi so sánh kích thước với thang chuẩn. May mắn thay, các công ty đã tạo ra một loại agarose đặc hiệu riêng cho kỹ thuật điện di trường xung đẩy. Mặc dù các nhà sản xuất không nói chính xác về sự khác nhau giữa hai loại agarose này nhưng hầu hết các agarose phù hợp cho điện di trường xung đẩy thường có lực căng cao và hàm lượng các chất nhiễm tích điện âm thấp (EEOs). Do đó, gel cho độ phân giải cao hơn gel thông thường, tuy nhiên các gel này thường dễ bị gãy trong quá trình thao tác, do đó nên đặt gel trong khay để di chuyển.
+ Lau sạch hệ thống điện di trường xung đẩy thường xuyên: Hệ thống PFGE là một mạng lưới phức tạp gồm các ống, bể điện di và thiết bị làm mát, do tính phức tạp của nó nên hệ thống này dễ dàng là môi trường sinh trưởng cho vi khuẩn, dẫn tới kết quả thu được không tốt.
Để ngăn chặn điều này, hãy rút hết các dung dịch trong hệ thống, đặc biệt là từ các ống nối sau mỗi lần chạy. Có thể bật bơm và chạy cho đến khi toàn bộ dung dịch đã được bơm ra hết trước khi kết thúc một lần chạy trong ngày. Nếu như hệ thống đã bị nhiễm, có thể bơm một dung dịch thuốc tẩy 50% vào hệ thống để loại bỏ các chất gây nhiễm. Tuy nhiên, cần chắc chắn rửa lại kỹ với nước cất một vài lần trước khi sử dụng.
+ Chú ý tới đệm điện di: Khi chạy trong một thời gian dài, cần tránh không được để cạn kiệt đệm điện di. Tốt nhất là nên sử dụng đệm TBE cho tất cả các lần điện di, đệm TAE có thể được sử dụng trong điện di thông thường, tuy nhiên, nhìn chung đệm này không phù hợp để điện di trong thời gian dài. Thêm vào đó, cũng cần bổ sung đệm mới sau mỗi 12-15 tiếng.
Điện di trường xung đẩy nghe có vẻ phức tạp nhưng hãy nhớ rằng nó cũng không khác biệt nhiều so với điện di thông thường. Chỉ cần đảm bảo rằng DNA được chuẩn bị cẩn thận và đệm luôn đầy đủ và tươi mới thì mọi việc sẽ ổn thôi!
Nguồn:
1. Nat Graham , “Pulsed Field Gel Electrophoresis – The Basics”, Bitesizebio.
https://bitesizebio.com/29971/pulsed-field-gel-electrophoresis/
2. Nat Graham, “Pulsed Field Gel Electrophoresis: Tips and Tricks”, Bitesizebio.
Xem thêm bài viết về Điện di trường xung đẩy tại đây.
