Việc phân tích trình tự DNA sử dụng enzyme giới hạn đã được áp dụng phổ biến từ những năm 1970. Ngày nay, công nghệ tưởng như “lỗi thời” này vẫn được coi là một trong những phương pháp phân tích trình tự DNA nhanh chóng và đơn giản hơn cả. Giống như hầu hết các hóa chất trong phòng thí nghiệm, enzyme giới hạn cũng có thể bị biến đổi, do đó bạn cần phải ghi nhớ một vài điều khi sử dụng và bảo quản. Thông thường, các enzyme cắt đầu dính hoạt động hiệu quả hơn các enzyme cắt đầu bằng. Chúng thường được sử dụng phổ biến trong các ứng dụng tách dòng do góp phần giảm khả năng tự đóng vòng của vector trong quá trình gắn (ligation).
Vậy muốn sử dụng hiệu quả enzyme giới hạn, chúng ta cần phải hiểu biết đầy đủ về chúng. Dưới đây là một số điều cần nhớ khi sử dụng enzyme giới hạn:
1. Sử dụng enzyme ở đúng điều kiện phản ứng
Mỗi enzyme khác nhau sẽ có điều kiện phản ứng khác nhau và đặc trưng, bao gồm:
- BSA hoạt động như một chất làm ổn địnhcho nhiều enzyme giới hạn.
- Hầu hết các enzyme hoạt động tối ưu ở nhiệt độ trên 37ºC.
- Một vài enzyme không hoạt động hiệu quả khi thời gian phản ứng kéo dài quá lâu (quá 1 – 2 giờ).
- Hầu hết enzyme hoạt động hiệu quả ở dải pH từ 7.2 đến 8.5. Do đó phải chắc chắn đã sử dụng đúng dung dịch đệm (buffer).
Đối với từng enzyme, luôn luôn thao tác cẩn thận và đọc kỹ hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Hầu hết các nhà cung cấp đều có hướng dẫn cụ thể đối với từng loại enzyme mà họ cung cấp.
Khi dùng 2 enzyme giới hạn cùng lúc trong khi điều kiện phản ứng của chúng không giống nhau, bạn có thể sẽ phải “hi sinh” 1 enzyme để enzyme còn lại được hoạt động ở điều kiện tối ưu của nó. Hãy lưu ý điều này khi bạn phân tích kết quả. Một cách làm khác tối ưu hơn là thực hiện 1 chuỗi các phản ứng liên tiếp. Xử lý xong mẫu với enzyme đầu tiên, hãy tinh sạch sản phẩm cắt bằng cách thôi gel để loại bỏ buffer trước khi bổ sung enzyme thứ 2. Nếu làm theo hướng này, thì nên làm nhiều ống phản ứng giống nhau, vì bạn có thể bị mất mẫu khi thôi gel.
Cuối cùng, đương nhiên bạn không muốn sản phẩm phản ứng bị quá nhiều khi điện di. Do gel agarose không có khả năng phân tách cao, và phụ thuộc vào phương pháp bạn phát hiện, thông thường bạn có thể phát hiện được một lượng nhỏ nhất từ vài nanogram (50-100ng) nếu sử dụng Ethidium bromide đến vài microgram. Mặc dù bạn có thể tra một lượng khá lớn lên gel nhưng không nên tra quá 1µg/giếng do chúng sẽ gây khó khăn trong việc nhận biết từng băng riêng lẻ.
2. Sự methyl hóa: Thiên thần và ác quỷ
Khi vi khuẩn sao chép một plasmid, chúng thường gắn gốc methyl vào các đảo CpG đặc hiệu. Những trình tự kiểu như thế này thường là đích cho sự methyl hóa. Quá trình methyl có thể khóa một vị trí khỏi sự cắt của enzyme giới hạn. Điều này có thể gây cản trở nếu enzyme bạn sử dụng là loại nhạy với sự methyl hóa, đơn giản là vì chúng không thể gắn vào các vị trí nhận biết đã bị methyl hóa.
Có 3 loại enzyme methyl hóa khác nhau được tìm thấy ở E.coli: enzyme Dam methylase, Dcm methyltransferase và EcoKI methylase. Nếu bạn muốn cắt 1 vị trí giới hạn đã bị methyl hóa, bạn có thể dùng một chủng E.coli không có khả năng methyl hóa (ví dụ JM11) để biến nạp plasmid của bạn. Các chủng này không thể methyl hóa DNA, do đó cho phép enzyme giới hạn nhận ra vị trí CpG. Lưu ý rằng phần đã xóa (đánh dấu bằng Δ) hoặc các gen đã bị xóa là dữ liệu quan trọng trong phân định genotype. Chúng giúp ta tìm ra các chủng có trạng thái methyl hóa một cách chính xác.
Mặt khác, quá trình methyl hóa plasmid có thể được xem như 1 phần của giai đoạn khởi đầu phản ứng. Ví dụ như, trong suốt quá trình SDM (Site-directed mutagenesis -SDM là một kỹ thuật dùng để gây đột biến trên một vài bazo của plasmid. Cách này cũng có thể làm thay đổi thành phần amino acid, phả hủy các vị trí liên kết với nhân tố phiên mã hoặc tạo ra các protein cộng gộp), sử dụng phản ứng PCR và tách dòng để gây đột biến 1 phần trong trình tự DNA, chúng ta có thể tìm ra được bản chất của của DNA plasmid sẽ được methyl hóa trong khi phản ứng PCR (nếu khuếch đại thành công) không làm được. Do đó, quy trình thực hiện sẽ bao gồm bước cắt DNA plasmid khuôn bằng DpnI, chỉ để lại sản phẩm PCR dùng cho phản ứng gắn nối (ligation) tạo thành plasmid.
3. Tránh phản ứng không đặc hiệu: hạn chế phản ứng không đặc hiệu ở mức tối thiểu
Dùng enzyme giới hạn cũng luôn có những mặt trái của nó. Trong điều kiện chuẩn, chúng vẫn có thể hoạt động không đặc hiệu, như cắt DNA một cách ngẫu nhiên chứ không phải ở đúng các vị trí cắt đặc hiệu như lý thuyết. Hiện tượng này gọi là Star Activity, thông thường là do thời gian ủ phản ứng kéo dài quá lâu (xem hướng dẫn sử dụng của từng enzyme) hoặc các yếu tố của dung dịch đệm không tối ưu (ví dụ như pH). Vì thế, chúng ta cần pha enzyme trong đúng dung dịch đệm mà nhà sản xuất khuyến cáo.
Hơn nữa, nồng độ glycerol cũng làm tăng hoạt tính Star Actvity do hầu hết enzyme và dung dịch đệm đi kèm được bảo quản trong glycerol, do đó bạn nên pha loãng cả đệm và enzyme trước khi sử dụng. Đây cũng là lý do vì sao nhiều nhà sản xuất gợi ý nên thực hiện phản ứng ở thể tích tổng từ 25-50µl và đệm cung cấp thường ở nồng độ 10X.
4. Vị trí cắt quá gần – hãy để cho enzyme một vài khoảng trống
Bạn nên biết rằng một số enzyme sẽ hoạt động hệu quả hơn nếu đằng trước vị trí cắt của chúng còn trống một vài cặp bazơ. Điều này lại càng cần thiết cho trường hợp bạn muốn cắt bằng đồng thời cả 2 enzyme và vị trí cắt của chúng gần nhau. Việc này cũng được lưu ý khi thực hiện phản ứng cắt trên vị trí gần cuối của sản phẩm PCR.
Các nhà sản xuất đều có những hướng dẫn cụ thể đối với sản phẩm của họ, tuy nhiên họ thường khuyên người dùng nên để ít nhất 6 nucleotide ở trước vị trí cắt của enzyme. Cách đơn giản nhất là thêm các nucleotide này vào trình tự mồi, tất nhiên vẫn phải giữ được tính đặc hiệu của mồi và hạn chế hình thành primer dimer.
5. Isochizomers và Neoschizomer
Isochizomers: cặp enzyme giới hạn có chung trình tự nhận biết và vị trí cắt.
Neoschizomers: cặp enzyme giới hạn có chung trình tự nhận biết nhưng lại cắt ở 2 vị trí khác nhau.
Đôi khi bạn cần một enzyme giới hạn mà các điều kiện tối ưu của nó không phù hợp với điều kiện thí nghiệm của bạn. Khi ấy isochizomers và neoschizomers có thể giúp bạn thiết kế thị nghiệm hiệu quả mà vẫn không ảnh hưởng đến kết quả cuối cùng.
Một isochizomer là một enzyme giới hạn nhận biết cùng 1 vị trí cắt với 1 enzyme giới hạn khác nhưng lại có đặc tính hoàn toàn khác enzyme kia. Ví dụ như: cả SinI và AvalI đều nhận biết trình tự cắt là G/G(A hoặc T)CC nhưng AvalI lại nhạy với methyl hóa còn SinI thì không. Vì thế, nếu bạn muốn cắt trình tự này mà không muốn sử dụng chủng E.coli không nhạy cảm với methyl hóa, thì bạn phải chọn SinI chứ không chọn AvalI.
Vị trí cắt của AvalI và SinI
Hai enzyme giới hạn có chung trình tự nhận biết nhưng lại cắt ở 2 vị trí nucleotide khác nhau được gọi là neoschizomers. Loại này thường được sử dụng để tránh Star Acitivity và/hoặc nhạy với methyl hóa. Ví dụ: cả KpnI và Acc65I đều có trình tự nhận biết là: GGTACC nhưng lại cắt ở 2 vị trí khác nhau, KpnI cắt sau trình tự GGTAC/C 5bp: còn Acc65I lại cắt sau trình tự G/GATCC 1bp. KpnI có thể gây ra Star Activity trong khi Acc65I lại hoạt động tốt hơn. Vì thế nếu không quá quan trọng về vị trí cắt, nên chọn Acc65Ithay vì KpnI.
Vị trí cắt của Acc65I và KpnI
Cả isochizomers và neoschizomers đều rất hữu ích trong việc cắt DNA tạo đầu dính, do đó có thể giúp phá vỡ Star Activity. Cả 2 loại enzyme này đều đảm bảo được quá trình methyl hóa và giữ được hoạt tính enzyme. Thông thường sản phẩm cuối cùng sẽ giống hệt nhau hoặc chỉ khác nhau đôi chút.
Hi vọng rằng 5 điều chú ý trên đây sẽ giúp ích nhiều cho bạn trong quá trình sử dụng enzyme giới hạn.
Nguồn:
Ania Wronski, “Restriction Enzymes: Five Things to Consider Before you Chop!”, Bitesizebio.
