» »Unlabelled » Vai trò của xét nghiệm sinh học phân tử trong viêm gan siêu vi mạn tính

03:57
0
Vai trò và ý nghĩa các xét nghiệm sinh học phân tử trong viêm gan siêu vi mạn tính


TS. BS. Phạm Hùng Vân


 


Xét nghiệm phát hiện HBsAg và anti-HCV là các xét nghiệm hết sức cần thiết để phát hiện và sàng lọc người bị nhiễm HBV hay HCV. Tuy nhiên, các xét nghiệm này không thể được sử dụng cho chẩn đoán bệnh viêm gan mạn tính trên bệnh nhân. Chính vì vậy mà các xét nghiệm phát hiện HBeAg cũng như phát hiện antiHBC (IgM) được sử dụng để đánh giá tình trạng hoạt động của HBV trong cơ thể bệnh nhân nhiễm HBV, ngoài ra xét nghiệm phát hiện antiHBe cũng được các nhà lâm sàng sử dụng để đánh giá sự chuyển đổi huyết thanh cho biết đáp ứng điều trị trên bệnh viêm gan mạn tính do HBV. Ngày nay, các xét nghiệm sinh học phân tử ngày càng được sử dụng nhiều để giúp các bác sĩ cho chỉ định điều trị cũng như theo dõi hiệu quả điều trị đặc hiệu bệnh viêm gan siêu vi mạn tính do HBV hay HCV mà trong bài báo cáo sẽ trình bày một cách chi tiết, kể cả các xét nghiệm phát hiện đột biến kháng thuốc trên HBV hay xét nghiệm xác định kiểu gene IL28B để tiên đoán hiệu quả điều trị interferon. Một sự trở lại ngoạn mục của một xét nghiệm huyết thanh cổ điển là xét nghiệm định lượng HBsAg cũng được đề cập đến nhờ ý nghĩa của xét nghiệm trong sự đánh giá hiệu quả điều trị interferon trên bệnh nhân viêm gan siêu vi mạn tính do HBV.



Abstract

The detection of the HBsAg and the anti-HCV are the critical assays to detect and to screen the HBV and HCV infection. However, these assays could not be used to determine the situation of chronic viral hepatitis on the patients. Due to this reason, the detection of HBeAg as well as the antiHBc (IgM) were previously used to evaluate the active situation of HBV in the HBV infected patients, and the appearance of anti-HBe was also used as the parameter to demonstrate the sero-conversion that predict the effectiveness of the specific treatment. Todays the molecular biology assays are replaced the serological assay and are applied  more and  more often to help the clinicians to prescribe and follow-up the specific treatment on the patients with chronic hepatitis caused by HBV and HCV. The details are described in this article, including the more advance assays like the mutations detection or the IL28B SNP detection that the clinicians can refer to evaluate the antiviral resistances (HBV) and to predict the effectiveness of the interferon treatment. The fantastic come back of the conventional serological assay, the HBsAg, is also presented in this artical due to clinical relevent role of this HBsAg quantitative to follow-up the effectiveness of interferon treatment on the chronic B hepatitis.



Xét nghiệm sinh học phân tử trong viêm gan B Xét nghiệm phát hiện và định lượng HBV-DNA


Đa số người bị nhiễm virus viêm gan B thì sẽ có được đáp ứng miễn dịch bảo vệ, tức là sẽ tạo được kháng thể chống HBsAg (gọi là anhti-HBsAg) và tiêu diệt được virus viêm gan B. Người đó khi thử máu sẽ dương tính anti-HBsAg. Tuy nhiên có một số người hệ miễn dịch lại không thể tạo ra được kháng thể bảo vệ này nên thử máu lúc nào cũng dương tính với HBsAg. Trong cơ thể của người đó có một sự đấu tranh qua lại giữa hệ miễn dịch và virus. Nếu hệ miễn dịch cân bằng được hay ưu thế hơn thì sẽ kiềm hãm không cho virus nhân bản được thành các virus hoàn chỉnh do vậy mà sẽ không có hay sẽ có rất ít virus hoàn chỉnh vào trong máu. Những trường hợp này được gọi là người lành mang virus, nếu thử máu sẽ thấy HBsAg dương tính nhưng dấu hiệu cho thấy có virus hoàn chỉnh là HBV-DNA, tức là acid nhân của virus, thường âm tính hay dương tính với số lượng (số copies) rất thấp (<105/ml). Nhưng nếu hệ miễn dịch không kiềm hãm được mà để virus thắng thế thì chúng sẽ nhân bản được nhiều trong tế bào gan tạo ra được nhiều virus hoàn chỉnh vào máu của bệnh nhân và lúc này thử máu sẽ thấy HBsAg dương tính đồng thời có virus hoàn chỉnh hiện diện trong máu với số lượng cao phát hiện thông qua xét nghiệm HBV-DNA cho kết quả dương tính và số lượng vượt trên 105 copies/ml. Trong trường hợp này cần phải xác định gan người bệnh có bị tổn hại không, tức là người đó có bị viêm gan mạn tính không? Nếu xác định là bị viêm gan mạn tính thì phải được điều trị đặc hiệu. Do vậy, nếu một người bị HBsAg dương tính, chúng ta cần phải thử máu xem HBV-DNA có bị dương tính không và số lượng bao nhiêu? Đây chính là xét nghiệm phát hiện và định lượng HBV-DNA[2,9,23]. Nếu HBV-DNA dương tính với số

lượng quá 105/ml thì phải tiếp tục xem men gan (là thử nghiệm ALT hay SGPT) của họ có cao không? Nếu cao vượt ngưỡng 2 lần bình thường (ALT bình thường là 19 IU ở nữ[8]  và 33 IU ở nam[8]) thì được coi là viêm gan mạn tính và phải điều trị. Nếu men gan bình thường thì cần phải chắc chắn là tế bào gan có bị thương tổn không thông qua xét nghiệm về hình thái tế bào gan như sinh thiết gan hay fibroscan. Nếu kết quả cho thấy có thương tổn thì họ cũng phải được xem là đang bị viêm gan mạn tính và phải cần điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân dù men gan bình thường. Xét nghiệm phát hiện và định lượng HBV-DNA là một loại xét nghiệm sinh học phân tử, thông thường được thực hiện bằng kỹ thuật PCR định lượng, được gọi là qPCR hay real-time PCR. Về mặt nguyên tắc qPCR cũng giống như PCR nhưng có thêm một tính năng nữa là có thể đếm được có bao nhiêu bản gốc DNA trước khi được nhân bản nhờ một hệ thống quang học có khả năng phát hiện được phản ứng xảy ra trong ống nghiệm trong khi nhân bản xảy ra. Do áp dụng được đặc điểm PCR là một kỹ thuật mở hoàn toàn, người làm xét nghiệm có thể tự pha thuốc thử để làm xét nghiệm mà không phải bị lệ thuộc vào các kit xét nghiệm mua từ các hãng nước ngoài rất đắt tiền, nên hiện có nhiều phòng xét nghiệm tại Việt Nam thực hiện được xét nghiệm sinh học phân tử này. Tuy nhiên, nếu dựa trên hệ thống mở thì muốn kết quả xét nghiệm được chính xác, người làm xét nghiệm phải thực hiện đủ các chứng để kiểm soát không cho các sơ sót xảy ra trong quá trình làm xét nghiệm và các chứng này phải hiển thị trên kết quả xét nghiệm[42,43]. Đối với xét nghiệm qPCR phát hiện và định lượng HBV-DNA thì trong kết quả phải hiển thị được đường biểu diển chuẩn để chứng minh thao tác định lượng đạt chuẩn thông qua hệ số tương quan (R) của các mẫu chuẩn phải đạt trên 0.990 và hiệu quả phản ứng (E) phải đạt 90-105% và đồng thời chứng minh kết quả định lượng là được tính toán từ kết quả của các mẫu chuẩn được chạy song hành cùng với mẫu thử chứ không phải là được tính toán từ một công thức có sẵn[43]. Ngoài ra, nếu muốn kết luận một kết quả âm tính thì trong kết quả định lượng phải hiển thị được mẫu đó dương tính được với chứng nội tại để đảm bảo âm tính này là âm tính thật sự chứ không phải âm tính giả vì phản ứng khuếch đại bị ức chế.



Xét nghiệm qPCR phát hiện và định lượng HBV-DNA còn phải được dùng để theo dõi hiệu quả điều trị của các thuốc kháng virus mà bác sĩ chỉ định trên bệnh nhân. Nếu sau khi chỉ định điều trị khoảng 1–3 tháng mà kết quả xét nghiệm cho thấy lượng virus (được gọi là HBV-DNA copy hay IU) giảm được 100 lần (gọi là giảm 2 log) thì bác sĩ điều trị có thể đánh giá là thuốc kháng virus có hiệu quả. Hiện nay có khá nhiều thuốc kháng virus dành cho viêm gan B mạn tính rất hiệu quả, HBV bị ngăn chận không cho nhân bản rất nhanh. Chính vì vậy HBV-DNA biến mất khỏi máu sớm hơn là HbeAg, sẽ biến mất khỏi máu chậm hơn. Chính vì vậy HBV-DNA là một dấu ấn rất tốt để theo dõi được đáp ứng khá sớm của điều trị và hiện nay các nhà y học trên thế giới và tại Việt Nam đã thống nhất sử dụng HBV-DNA làm chỉ số theo dõi đáp ứng điều trị hơn là HbeAg.



Ngoài ra xét nghiệm này cũng phải được chỉ định cứ mỗi 3 tháng trong quá trình điều trị để đánh giá hiệu quả điều trị và nguy cơ kháng thuốc của virus trên bệnh nhân. Bất cứ khi nào kết quả phát hiện và định lượng HBV-DNA cho thấy có sự xuất hiện trở lại HBV-DNA trên ngưỡng phát hiện thì bác sĩ điều trị phải lưu ý vì đây chính là dấu hiệu cho thấy virus đang kháng thuốc điều trị hay bệnh nhân không tuân thủ liệu pháp điều trị mà bác sĩ đang chỉ định.



Xét nghiệm phát hiện đột biến kháng thuốc



Một người đã xác định là bị viêm gan virus B mạn tính nếu không được điều trị đặc hiệu thì virus sẽ không bị khống chế mà sẽ liên tục nhân bản trong tế bào gan và sẽ tàn phá tế bào gan với hậu quả sẽ dẫn đến xơ gan và từ thương tổn xơ gan, bệnh nhân có thể bị đi dần đến tình trạng xơ gan mất bù rồi chết, hay từ xơ gan có thể bị dẫn đến ung thư gan[14]. Cũng có trường hợp bệnh nhân bị ung thư gan mà không cần thiết phải qua giai đoạn xơ gan[14], đây chính là những trường hợp bệnh nhân tình cờ qua khám sức khoẻ thấy bị khối u trong gan (qua siêu âm chẩn đoán) rồi sau đó bị xác định là ung thư gan, xét nghiệm máu cho thấy HBV-DNA dương tính với số copies cao (>105). Chính vì vậy mà nếu đã được chẩn đoán là bị viêm gan B mạn tính (tiêu chuẩn chẩn đoán là HBV-DNA trên 105 copies/ml, ALT cao gấp 2 lần bình thường hay xét nghiệm sinh thiết hoặc fibroscan thấy tổ chức gan bị tổn thương) thì nhất thiết phải được điều trị đặc hiệu để kiềm chế không cho virus nhân bản gây tổn thương gan. Nhiều nghiên cứu cho thấy nếu không được điều trị để khống chế số lượng virus hoàn chỉnh trong máu bệnh nhân luôn dưới ngưỡng phát hiện thì nguy cơ xơ gan hay ung thư gan ở những người này sẽ rất cao [2,9,23].

Thời gian điều trị bằng thuốc kháng virus có thể sẽ kéo dài trong nhiều năm vì cho đến nay các nhà y học chỉ đạt đến thành công là khống chế được virus không cho nhân bản chứ rất hiếm khi loại trừ được virus [2,9,23] vì chúng tồn tại trong tế bào gan ở dạng cccDNA (covalently closed circular DNA) không bị tác động bởi thuốc kháng virus. Do phải điều trị thuốc kháng virus một thời gian dài nên virus có cơ hội tiếp xúc với thuốc kháng virus và như vậy là chúng có cơ hội bị đột biến để kháng thuốc. Do vậy nếu trong thời gian điều trị, xét nghiệm theo dõi virus là HBV-DNA bỗng nhiên bị trở lại dương tính và lượng HBV-DNA bị tăng lên dần thì đây chính là dấu hiệu cho biết virus có khả năng kháng lại thuốc đang điều trị. Lúc này cần phải xét nghiệm để phát hiện xem thuốc có bị virus đề kháng không? Hiện nay công ty Nam Khoa đã phát triển được phương pháp giải trình tự một đoạn gen 700bases trên vùng gene rt của virus để có thể phát hiện được tất cả điểm đột biến giúp virus kháng được lamivudine, adefovir, entecavir và tenofovir [1]. Có thể ví kỹ thuật này như là kỹ thuật làm kháng sinh đồ dành cho HBV, vượt trội hơn nhiều kỹ  thuật khác chỉ có thể phát hiện từng đột biến một cho từng thuốc kháng virus một. Do vậy mà sẽ cung cấp cho bác  sĩ  nhiều thông tin hơn  để cho quyết định chính xác hơn là  liệu có  nên thay đổi thuốc không.



Xét nghiệm phát hiện đột biến precore và core promoter



Trong bộ gen (DNA) của virus viêm gan B có một gene được gọi là gene tiền lõi, mã hóa thông tin di truyền giúp virus sinh ra được kháng nguyên e (HBeAg) và kháng nguyên này được virus tiết ra ngoài khi nó nhân bản. Do vậy nếu trong máu bệnh nhân có sự xuất hiện HBeAg thì có nghĩa là có sự nhân bản của virus trong cơ thể. Nếu bệnh nhân được điều trị bằng thuốc kháng virus thì virus sẽ bị chặn lại và không nhân bản được đồng thời hệ thống miễn dịch nhận diện HBeAg của bệnh nhân có cơ hội phát triển do vậy mà trong máu bệnh nhân xuất hiện được kháng thể chống HBeAg (gọi là anti-HBeAg). Trường hợp này y học gọi là có chuyển đổi huyết thanh chứng minh được hệ miễn dịch thắng thế với các kết quả xét nghiệm cho thấy HBeAg trở nên âm tính, anti-HBeAg dương tính và HBV-DNA không phát hiện được hay phát hiện được nhưng số lượng rất thấp. Tuy nhiên trong bệnh nhân bị viêm gan B mạn tính, quá trình đấu tranh giữa virus với hệ miễn dịch của cơ thể cũng đã thúc đẩy virus viêm gan B có nguy cơ tạo ra một đột biến tại vùng precore (codon 1896) tạo nên một mã kết thúc trên gene này hay đột biến tại vùng core promoter (codon 1762 hay 1764) do vậy mà virus không thể tổng hợp được kháng nguyên HBeAg [20], lúc này virus được gọi là bị đột biến precore và/hay core promoter. Đột biến precore và đặc biệt đột biến core promoter[4,19,21,28,47] có liên hệ rất cao với nguy cơ ung thư gan trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Do vậy, trên một bệnh nhân viêm gan B mạn đang được điều trị với thuốc kháng virus, nếu kết quả xét nghiệm cho thấy HBeAg âm tính, AntiHBeAg dương tính, nhưng HBV-DNA lại xuất hiện dương tính, đồng thời men gan trồi sụt thất thường, thì đây chính là dấu hiệu báo động nguy cơ virus đột biến precore và/hay core promoter. Trong trường này, cho chỉ định xét nghiệm phát hiện đột biến precore/core promoter là rất cần thiết. Xét nghiệm phát hiện đột biến precore/core promoter hiện nay đã được công ty Nam Khoa thực hiện bằng giải trình tự với nguyên tắc là dùng PCR khuếch đại một đoạn dài 250 bases trên vùng gene preC chứa các vị trí (1762, 1764 và 1896) rồi giải trình tự trực tiếp để phát hiện xem có đột biến tại vị trí này hay không [44]. Một kết quả phát hiện có đột biến precore và/hay core promoter trên bệnh nhân bắt buộc bệnh nhân phải được điều trị suốt đời hay điều trị cho đến khi HBsAg biến mất.



Xét nghiệm định lượng HBsAg



Thuốc kháng virus không thể là giải pháp giúp điều trị khỏi hẵn bệnh trên các bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Do vậy, hiện nay các nhà điều trị đang trông chờ liệu pháp interferon vì đã có nhiều chứng cứ y học cho thấy interferon phối hợp với thuốc kháng virus có thể giúp loại trừ HBV vĩnh viễn ra khỏi bệnh nhân chứng minh được qua sự biến mất HBsAg trong máu, tức là xét nghiệm HBsAg trở nên âm tính trong quá trình điều trị. Tuy nhiên không phải bệnh nhân nào được điều trị bằng liệu pháp trên đều có được kết quả khỏi bệnh. Chính vì vậy phải có xét nghiệm giúp theo dõi để tiên đoán được hiệu quả điều trị bằng interferon. Xét nghiệm phát hiện và định lượng HBV-DNA không thể làm được điều này vì ngay sau khi điều trị một thời gian ngắn thì HBV-DNA trong máu của bệnh nhân đã trở nên âm tính. Các nhà nghiên cứu đã cho thấy có một sự liên hệ rất rõ ràng giữa sự thay đổi về lượng của kháng nguyên HBsAg trong máu của bệnh nhân với hiệu quả điều trị interferon. Nếu trong quá trình điều trị, lượng HBsAg trong máu giảm một cách có ý nghĩa sẽ chứng minh được liệu pháp interferon là có hiệu quả trên bệnh nhân [13, 22]. Chính nhờ phát hiện này mà một xét nghiệm miễn dịch cổ điển là xét nghiệm HBsAg đã quay trở lại thành một xét nghiệm không thể thiếu được nếu bác sĩ muốn chỉ định điều trị interferon kết hợp thuốc kháng virus trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính của mình. Dù là xét nghiệm cổ điển nhưng do phải có kết quả định lượng theo IU (đơn vị quốc tế) nên chỉ có một vài hệ thống kín đã được chấp nhận mới có thể thực hiện được. Đây cũng chính là lý do tại sao xét nghiệm định lượng HBsAg hiện nay còn khá đắt so với các xét nghiệm miễn dịch thông thường khác như định tính HBsAg, anti-HBsAg, HBeAg, anti-HBeAg, anti-HBcAg…


Xét nghiệm định lượng cccDNA trong sinh thiết gan hay trong máu



Ngay sau khi HBV-DNA đi vào nhân tế bào gan, cccDNA được thành lập và trở thành chất liệu di truyền để từ đó phiên mã thành các gene điều khiển sự tổng hợp các thành phần cấu trúc và chức năng của HBV. Sự phát hiện và định lượng được cccDNA rất có ý nghĩa chứng minh được hiệu quả điều trị đặc hiệu của thuốc kháng virus hay của interferon là có loại trừ được virus ra khỏi bệnh nhân hay không [17]. Về nguyên tắc thì cccDNA chỉ có thể tìm thấy trong tế bào gan, tuy nhiên cccDNA vẫn có thể tìm thấy được trong máu. Xét nghiệm real-time PCR định lượng cccDNA [37] trong sinh thiết gan và cả trong huyết thanh có khả năng trở thành một xét nghiệm rất cần thiết để đánh giá hiệu quả điều trị đặc hiệu bằng thuốc kháng virus và interferon trên bệnh nhân.



Xét nghiệm xác định kiểu gene HBV



Trước đây các nhà nghiên cứu phải dựa trên các dấu ấn của kháng nguyên bề mặt (HBsAg) của HBV để phân biệt các nhóm HBV. Ngày nay nhờ sự hiểu biết cặn kẽ về trình tự của bộ gene HBV, các nhà nghiên cứu đã phân ra được 9 genotype khác nhau (A-I) [24,25,29,30]. Sự phân bố genotype là rất tùy thuộc vào địa dư, ví dụ tại Mỹ genotype chủ yếu là A, C và sau đó là B [24], còn tại Việt Nam thì chủ yếu là C rồi đến B [11,12,38,40,45]. Genotype của HBV liên quan khá nhiều đến tiến triển bệnh, đột biến và kháng thuốc. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy genotype C có dự hậu kém, đáp ứng kém với thuốc kháng virus, nguy cơ đột biến core promoter cao và nguy cơ ung thư gan cao hơn genotype B [7]. Do ý nghĩa như vậy nên nhiều nhà lâm sàng cho chỉ định xét nghiệm xác định genotype HBV. TS. Kenji Abe của Viện Nghiên Cứu Bệnh Nhiễm Tokyo đã phát triển một kỹ thuật nested multiplex PCR để xác định genotype HBV có thể áp dụng tại các phòng thí nghiệm có phương tiện PCR [25]. Đối với các phòng thí nghiệm có phương tiện giải trình tự như phòng thí nghiệm của công ty Nam Khoa thì ngoài phương pháp của Kenji Abe, chúng tôi cũng đã xây dựng xét nghiệm vừa phát hiện đột biến precore/core promoter vừa xác định genotype [44], hay xét nghiệm vừa phát hiện đột biến kháng thuốc vừa xác định genotype dựa trên cơ sở giải trình tự phát hiện các đột biến muốn tìm rồi sau đó so chuỗi trên gene bank với chương trình blast search để xác định genotype của trình tự giải được [1,45]. Với giải pháp này thì bác sĩ không cần cho chỉ định tìm genotype nhưng vẫn có được thông tin về genotype đi kèm với kết quả phát hiện các đột biến precore/core promoter hay đột biến kháng thuốc.



Xét nghiệm phát hiện đột biến mất đoạn trên gene PreS2



TS. Kenji Abe đã phát hiện được là trên các mẫu ung thư gan lấy từ bệnh nhi bị ung thư gan tại Việt Nam là có tỷ lệ cao phát hiện được HBV-DNA, và có đến 36% là có đột biến mất đoạn trên gene PreS2. Đột biến này đã được xác định là có vai trò trong ung thư gan [18]  vì qua công trình nghiên cứu của các nhà khoa học tại Đài Loan, nhóm nghiên cứu đã gây ung thư gan thực nghiệm trên chuột [34, 46]. Với chứng cứ này, các nhà y học cũng phải quan tâm đến xét nghiệm truy tầm đột biến mất đoạn PreS2 trên các bệnh nhân viêm gan B mạn tính để có thể phát hiện được sớm nguy cơ ung thư gan. Công ty Nam Khoa với sự hợp tác của TS. Kenji Abe đã xây dựng được thành công kỹ thuật PCR rồi giải trình tự để phát hiện đột biến gây ung thư quan trọng này và sẵn sàng hợp tác cùng các nhà nghiên cứu và điều trị để có được các nghiên cứu rộng hơn về căn nguyên ung thư gan, hiện được thống kê là ung thư hàng đầu tại Việt nam.



Xét nghiệm phát hiện đột biến trốn thoát vaccine của HBV



Một người đã chích ngừa viêm gan B và có kháng thể bảo vệ (anti-HBsAg) vẫn có nguy cơ nhiễm HBV và dẫn đến viêm gan mạn tính cao nếu sau khi chủng ngừa họ bị nhiễm bởi chủng virus mang đột biến trốn thoát vaccine. Chủng đột biến trốn thoát vaccine có đột biến tại codon 145 (Gly145Arg/Lys) và chính do sự đột biến này mà virus đã thay đổi được tính kháng nguyên của epitope “a” để trốn thoát được khả  năng bảo vệ của kháng thể chống HBsAg và nhờ đó mà nhiễm được trên bệnh nhân và gây bệnh [3,15,16].



Với vị trí đột biến đã xác định và với cơ chế gây bệnh rõ ràng như vậy, chúng tôi cho là các nhà điều trị cũng như nghiên cứu phải quan tâm đến vấn đề phát hiện đột biến trốn thoát vaccine trên các bệnh nhân tồn tại song song trong huyết thanh vừa anti-HBsAg vừa HBsAg, hay trên các bệnh nhân sau khi chủng ngừa mà tự nhiên lại xuất hiện HBsAg và biến mất anti-HBsAg. TS. Kenji Abe và phòng thí nghiệm của công ty Nam Khoa rất sẵn sàng để hổ trợ các nghiên cứu như vậy.






Hình 1: Bộ gene của HBV và các vùng đích mà dựa vào đó các xét nghiệm sinh học phân tử được triển khai tại phòng thí nghiệm NK-BIOTEK





Xét nghiệm sinh học phân tử trong viêm gan C Xét nghiệm phát hiện và định lượng HCV-RNA


Một người bị nhiễm virus viêm gan C thì thường hệ miễn dịch của người đó ít khi tạo được miễn dịch bảo vệ chống được virus. Do vậy sự xuất hiện kháng thể đặc hiệu HCV (anti-HCV) không có ý nghĩa là cơ thể đã có được miễn dịch bảo vệ loại trừ được virus. Chỉ có một số ít may mắn sẽ khỏi được nhờ các hệ thống chống đỡ không đặc hiệu khác của cơ thể loại trừ được virus, còn lại trong đa số các trường hợp, virus vẫn tồn tại, nhân bản trong tế bào gan và phóng thích virus vào trong máu. Do vậy, để có thể xác định một người có đang bị nhiễm HCV hay không, bác sĩ phải cho chỉ định làm xét nghiệm phát hiện và định lượng HCV-RNA, tức là tìm và định lượng được virus viêm gan C trong máu. Nếu xét nghiệm này cho kết quả HCV-RNA dương tính thì có nghĩa là trong máu của bệnh nhân có hiện diện virus viêm gan C, tức là bệnh nhân đang bị nhiễm HCV. Xét nghiệm phát hiện và định lượng HCV-RNA chính là một xét nghiệm sinh học phân tử, thông thường được thực hiện bằng kỹ thuật real-time PCR. Do bộ gene của HCV là RNA, do vậy để làm xét nghiệm, RNA của virus sau khi tách chiết được từ máu của bệnh nhân sẽ phải được phiên mã ngược (reverse transcription) thành DNA bổ sung, gọi là cDNA, trước khi thực hiện real-time PCR để phát hiện và định lượng. Chính vì vậy xét nghiệm này được gọi một cách chính xác hơn là RT-qPCR (RT là reverse transcription). Cũng giống như xét nghiệm qPCR phát hiện và định lượng HBV-DNA, đã có nhiều phòng xét nghiệm tại Việt Nam thực hiện được xét nghiệm sinh học phân tử này dựa trên hệ thống mở của kỹ thuật PCR. Cũng chính vì là hệ thống mở nên các kiểm soát về chất lượng phải được các phòng xét nghiệm quan tâm để tránh các sai lầm trong quá trình làm xét nghiệm, tức là phải luôn luôn làm xét nghiệm với các chứng và chuẩn để kiểm soát được các nguy cơ sơ sót có thể xãy ra trong quá trình làm xét nghiệm như là chúng tôi đã trình bày trong xét nghiệm phát hiện và định lượng HBV-DNA ở trên [42,43].



Một người sau khi nhiễm virus viêm gan C thì thường không có triệu chứng hay chỉ có một ít triệu chứng không đặc hiệu và mơ hồ. Tuy nhiên virus sẽ âm thầm xâm nhập và nhân bản trong tế bào gan và quá trình này diễn tiến rất lâu, có thể trên hàng chục năm, làm tế bào gan bị tàn phá dần dần, gây hậu quả viêm gan mạn tính rồi đi đến xơ gan, và có thể từ xơ gan dẫn đến ung thư gan. Nguy cơ của người đang bị nhiễm HCV dẫn đến viêm gan mạn tính rồi xơ gan và đến ung thư gan là khá cao (có thể 17-20%). Do vậy, khác với nhiễm virus viêm gan B cần phải xác định là đang bị viêm gan B mạn tính (ALT tăng cao hay có bất thường tổ chức gan phát hiện qua sinh thiết hay fibroscan) mới cần phải điều trị đặc hiệu. Một người bị xác định là đang nhiễm virus viêm gan C thì nên được chỉ định điều trị đặc hiệu mà không cần phải có các dấu hiệu chứng minh gan đã bị thương tổn vì viêm gan mạn tính. Tuy nhiên trước khi được điều trị, bệnh nhân phải nhất thiết được chỉ định làm hai xét nghiệm: định lượng HCV-RNA và định genotype HCV để bác sĩ có thể theo dõi được hiệu quả điều trị cũng như quyết định được thời gian điều trị đặc hiệu [26, 32].



Chỉ cần 1 tháng sau khi được điều trị đặc hiệu bằng liệu pháp interferon phối hợp với ribavirin, bác sĩ nên cho lại chỉ định phát hiện và định lượng HCV-RNA để xác định bệnh nhân có đáp ứng sớm với liệu pháp điều trị hay không? Nếu kết quả HCV-RNA trong máu bệnh nhân trở nên âm tính chỉ sau 1 tháng điều trị thì đây là một tín hiệu rất vui cho bệnh nhân, chứng tỏ bệnh nhân có đáp ứng sớm với điều trị và bác sĩ có thể rút ngắn thời gian điều trị cho bệnh nhân (có thể chỉ còn 1/2 năm). Nếu HCV-RNA trong máu bệnh nhân vẫn chưa biến mất thì bác sĩ phải chờ thêm 2 tháng nữa để làm lại xét nghiệm phát hiện và định lượng HCV-RNA, và nếu kết quả định lượng lần này cho thấy lượng virus không giảm hay giảm ít hơn 100 lần thì bác sĩ phải cân nhắc thay đổi phương thức hay có thể phải ngưng điều trị vì bệnh không đáp ứng với điều trị. Nếu kết quả định lượng cho thấy lượng virus giảm hơn 100 lần (chuyên môn gọi là giảm hơn 2 log) thì bác sĩ có thể đánh giá là phát đồ điều trị đặc hiệu có hiệu quả và lúc này sẽ phải quyết định thời gian điều trị là bao lâu. Quyết định này tuỳ thuộc vào genotype HCV mà bệnh nhân bị nhiễm là loại nào (biết được từ lần xét nghiệm đầu tiên trước khi quyết định điều trị cho bệnh nhân). Nếu không may mà bệnh nhân bị nhiễm HCV genotype 1 thì bác sĩ sẽ phải điều trị cho bệnh nhân với tổng thời gian ít nhất 12 tháng. Nếu bệnh nhân bị nhiễm HCV không phải genotype 1, mà là 2 hay 6 (tại Việt Nam, rất ít khi phát hiện được genotype HCV 3, 4, và 5) thì bác sĩ chỉ cần điều trị cho bệnh nhân với tổng thời gian 6 tháng.



Trước khi quyết định chấm dứt điều trị cho bệnh nhân thì bác sĩ sẽ phải chỉ định lại xét nghiệm phát hiện và định lượng HCV-RNA để xem virus có còn trong máu của bệnh nhân hay không. Nếu xét nghiệm này vẫn cho kết quả dương tính thì bác sĩ vẫn chưa thể ngưng điều trị mà phải tiếp tục thêm 3 tháng nữa cho đến khi kết quả trở nên âm tính. Sau khi chấm dứt điều trị, bác sĩ cũng phải thường xuyên theo dõi xem bệnh nhân có bị tái phát hay tái nhiễm không bằng xét nghiệm phát hiện và định lượng HCV-RNA trong máu của bệnh nhân mỗi 3 tháng một lần. Bất cứ lúc nào xét nghiệm trở nên dương tính thì bác sĩ sẽ phải xem như bệnh nhân bị tái phát hay tái nhiễm và phải trở lại điều trị đặc hiệu như ban đầu.



Xét nghiệm xác định genotype HCV



Genotype là các kiểu khác biệt của vi sinh vật cùng loài dựa vào sự khác biệt trình tự nucleotide trên bộ gene của vi sinh vật đó. Cho đến hiện nay, y học đã xác định là HCV có thể được phân làm 6 genotype lớn là 1 đến 6, tuy rằng cũng có khuynh hướng cho là có đến 11 genotype HCV. Trong từng genotype, HCV lại được phân thành các dưới type như genotype 1 có các dưới type là 1a, 1b, 1c; genotype 2 có các dưới type là 2a, 2b, 2c... Xét nghiệm xác định genotype HCV là một loại xét nghiệm sinh học phân tử và như trên đã trình bày, kết quả xác định genotype của HCV trên bệnh nhân rất có giá trị để giúp bác sĩ tiên đoán được hiệu quả điều trị, xác định được thời gian điều trị đặc hiệu, và liều ribavirin sử dụng cho bệnh nhân.



Trước đây, genotype HCV được xác định dựa vào sự khác biệt về trình tự trên vùng 5’ NC tức là vùng không mã hoá trên bộ gene của HCV, và cũng chính trên cơ sở này nhiều kỹ thuật xét nghiệm xác định genotype HCV đã ra đời như xét nghiệm inoLIPA lai trên vạch của Bayer (sau này là của Siemen) và giải trình tự vùng 5’ NC của Trugene (mà sau này là của Siemen). Tại Việt Nam, công ty Nam Khoa đã phát triển kỹ thuật vừa định lượng HCV-RNA vừa xác định được genotype của HCV dựa trên vùng 5’ NC[33, 41]. Nguyên tắc của kỹ thuật này là định lượng HCV-RNA trước bằng kỹ thuật qPCR rồi sau đó giải trình tự sản phẩm qPCR này để xác định genotype HCV bằng cách so chuỗi với thư viện genotype HCV của NCBI. Nhờ vậy với chỉ định xét nghiệm vừa xác định genotype HCV, vừa định lượng HCV-RNA mà bác sĩ cho trước khi quyết định điều trị đặc hiệu, bệnh nhân chỉ phải trả chi phí cho xét nghiệm xác định genotype HCV mà vẫn có được kết quả định lượng HCV-RNA. Ngoài kỹ thuật giải trình tự và lai trên vạch, kỹ thuật real-time PCR sử dụng dò Taqman cũng được phát triển để xác định genotype HCV dựa trên vùng 5’ NC và công ty Nam Khoa cũng là một trong các công ty phát triển kỹ thuật này.



Tuy nhiên gần đây các nhà nghiên cứu đã chứng minh là xét nghiệm xác định genotype HCV dựa trên sự khác biệt trình tự của vùng 5’ NC là không đủ sức để phân biệt được nhiều subtype của genotype 6 của HCV với genotype 1 [5,6]. Chính vì vậy sẽ có khá nhiều trường hợp được xác định genotype 1 nhưng thật ra là genotype 6. Để xác định chính xác genotype của HCV thì phải dựa trên giải trình tự vùng NS5B trên bộ gene của HCV [6,35]. Trong một công trình nghiên cứu phối hợp với chúng tôi, TS. Kenji Abe của Viện Nghiên Cứu Các Bệnh Nhiễm Trùng Tokyo đã phát triển phương pháp dùng PCR tổ để khuếch đại một vùng đặc hiệu trên vùng NS5B và sau đó giải trình tự sản phẩm khuếch đại để xác định genotype HCV. Công trình nghiên cứu này đã cho phép chúng tôi có một nhận định mới về tỷ lệ phân bố genotype HCV trên các mẫu huyết thanh lấy từ người Việt Nam nhiễm HCV, đó là có trên 60% các trường hợp là thuộc genotype 6 chứ không phải là genotype 1 như nhiều công trình trước đây đã công  bố. Ngoài ra, một nghiên cứu so sánh kết quả xác định genotype HCV dựa trên giải trình tự vùng 5’ NC với giải trình tự vùng NS5B cũng đã được chúng tôi thực hiện với kết quả cho thấy trên 40% các trường hợp genotype 6 bị xác định là genotype 1 nếu dựa trên trình tự vùng 5’ NC. Chính vì vậy, hiện nay với sự đồng ý của TS. Kenji Abe, chúng tôi đã triển khai kỹ thuật giải trình tự vùng NS5B tại công ty Nam Khoa để có thể giúp các nhà lâm sàng có thông tin chính xác hơn về genotype HCV vì chắc chắn rằng các kỹ thuật dựa trên giải trình tự vùng 5’ NC của Trugene, hay real-time PCR trên đích 5’ NC của HCV hiện đang được sử dụng tại Việt Nam là hoàn toàn không chính xác.



Xét nghiệm xác định công tắc interferon (interferon switch)



Điều trị bệnh nhân nhiễm HCV với liệu pháp Interferon không phải lúc nào cũng có kết qủa thành công: bệnh nhân khỏi bệnh hoàn toàn. Do vậy các nhà điều trị rất quan tâm là làm sao tiên đoán được hiệu quả điều trị interferon trên bệnh nhân. Trước đây một số nhà nghiên cứu cho là có thể do HCV bị đột biến trong quá trình điều trị nên đã kháng được interferon. Tuy nhiên hiện nay, qua một số công trình nghiên cứu rất công phu so sánh và đánh giá các khác biệt SNP của bộ gene người, các nhà nghiên cứu đã phát hiện được một vài vị trí trên vùng gene interleukin 28B (IL28B) là có liên quan đến khả năng thành công hay nguy cơ tái phát trên bệnh nhân nhiễm HCV được điều trị interferon [10,31,36,39]. Có 3 SNP của IL28B đã được xác định, đó là SNP (A) rs12979860, SNP (B) rs8099917, và SNP (C) rs12980275. SNP (A) chính là công tắc interferon: kiểu gene C/C  là công tắc bật (switch-on) và C/T là công tắc tắt (switch-off). Switch-on cho phép tiên đoán hiệu quả điều trị thành công interferon cao (trên 80%) với ít nguy cơ tái phát và tiến triển mạn tính hơn so với switch-off tiên đoán hiệu quả điều trị thấp với nguy cơ tái phát và tiến triển mạn tính cao. Tại công ty Nam Khoa, chúng tôi đang làm nghiên cứu xác định công tắc interferon trên các bệnh nhân nhiễm HCV bằng kỹ thuật giải trình tự. Kết quả cho thấy có khoảng 20% bệnh nhân là interferon swith-off. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy trên các mẫu mà chúng tôi nghiên cứu (trên 100 mẫu) thì ba SNP này là có liên quan với nhau do vậy chỉ cần làm xét nghiệm xác định SNP (A) là đủ chứ không cần phải xác định thêm SNP (B) và SNP (C) nữa.


Xét nghiệm xác định công tắc interferon là rất có ý nghĩa vì kết quả xét nghiệm có thể giúp bác sĩ tư vấn khả năng thành công của liệu pháp interferon trên bệnh nhân. Ngoài ra trên các bệnh nhân đã điều trị với kết quả HCV-RNA đã âm tính mà bác sĩ chưa làm xét nghiệm xác định genotype của HCV trên bệnh nhân, bác sĩ có thể cho chỉ định xác định công tắc interferon để có thể quyết định được thời gian điều trị cũng như tiên đoán hiệu quả điều trị thay thế cho xét nghiệm xác định genotype HCV lúc này không thể thực hiện được vì HCV-RNA đã biến mất trên bệnh nhân rồi. Chính vì khả năng hữu dụng cao của xét nghiệm này nên chúng tôi đã nghiên cứu áp dụng thành kỹ thuật real-time PCR sử dụng dò taqman xác định công tắc interferon với mong muốn xét nghiệm này được đưa ra sử dụng rộng rãi trên nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng có phương tiện PCR.







Hình 2: Bộ gene của HCV và các vùng đích mà dựa vào đó các xét nghiệm sinh học phân tử được triển khai tại phòng thí nghiệm NK-BIOTEK


Xét nghiệm phát hiện đột biến core trên HCV



Ngoài công tắc interferon, đã có ghi nhận đột biến thay thế aminoacid (aa) 70 và 91 trên vùng core của HCV thuộc genotype 1b cũng có liên quan đến sự đáp ứng thành công với liệu pháp interferon phối hợp với ribavirin[27]. Các ghi nhận này cũng mở ra một hướng tiếp cận mới mà các nhà điều trị hay nghiên cứu nên quan tâm, đó là tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến precore, công tắc interferon và genotype của HCV đối với đáp ứng điều trị interferon phối hợp với thuốc kháng virus. Phòng thí nghiệm NK-Biotek hiện đã có đủ phương tiện để có thể cùng phối hợp nghiên cứu trên lĩnh vực mới, thú vị và cũng đầy thách thức này.



Kết luận



Việt Nam là một trong các quốc gia có tỷ lệ nhiễm viêm gan B cao nhất thế giới, đối với viêm gan C thì Việt Nam bị xếp vào nhóm các quốc gia có tỷ lệ nhiễm trong dân số đứng hạng nhì. Có lẽ chính vì như vậy mà tại Việt Nam hiện nay, ung thư gan được xếp vào đầu danh sách ung thư, cao hơn cả ung thư phổi.



Viêm gan B mạn và nhiễm viêm gan C không phải là các bệnh lý không thể trị được, đó là các bệnh lý không chỉ điều trị được mà còn có thể trị khỏi được. Tuy nhiên để có thể cho được chỉ định điều trị cũng như theo dõi được hiệu quả điều trị thì các nhà điều trị cần phải có các thông tin cần thiết đến từ các xét nghiệm sinh học phân tử. Với sự tiến bộ về kỹ thuật cũng như sự hiểu biết cặn kẽ về bộ gene của HBV và HCV, các xét nghiệm sinh học phân tử để phục vụ cho mục đích chẩn đoán và theo dõi hiệu quả điều trị viêm gan B mạn tính và nhiễm HCV là không có gì khó khăn tại Việt Nam. Có thể nói chúng ta đã có những phòng thí nghiệm có khả năng lột trần toàn bộ các bí ẩn của bộ gene HBV và HCV trên bệnh nhân. Bài viết này nhằm mục đích giúp các nhà nghiên cứu và điều trị rõ hơn về các khả năng này để không chỉ tận dụng mà còn mở ra được các hợp tác nghiên cứu sâu và có trình độ tương đương quốc tế về HBV và HCV tại Việt Nam. Cơ sở để chúng tôi nói vậy vì hiện nay chúng ta đang có được một sự hợp tác rất chặt chẽ và bình đẳng với một chuyên gia hàng đầu trong lĩnh vực này, đó là TS. Kenji Abe của Viện Nghiên Cứu Bệnh Nhiễm Trùng tại Tokyo.



Tài liệu tham khảo

1. An V. D. X, Van. P. H. et al. Direct sequencing the polymerase gene amplified from the HBV genome isolated from patients’ sera to detect the mutations causing the resistance to lamivudine, adefovir, and entecavir. Proceeding of the 2nd National Conference in Medical Molecular Biology. (Ha Noi, 18-19 Sep 2010). Pp 198-199

2. Anna S. F. Lok and Brian J. McMahon. AASLD PRACTICE GUIDELINES - Chronic Hepatitis B. Hepatology, 2007 Feb; 45 (2): 507-539

3. Carman, W. F., The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus, J. Viral. Hepat., 4 (Suppl. 1), 11, 1997.

4. Chan HLY, Hussain M, Lok ASF. Different hepatitis B virus genotypes are associated with different mutations in the core promoter and precore regions during hepatitis B e antigen seroconversion. Hepatology 1999;29:976–984.

5. Chen, Z., and K. E. Weck. (2002). Hepatitis C virus genotyping: interrogation of the 5_ untranslated region cannot accurately distinguish genotypes 1a and 1b. J. Clin. Microbiol. 40:3127–3134.

6. Chinchai, T., J. Labout, S. Noppornpanth, A. Theamboonlers, B. L. Haagmans, A. D.  Osterhaus, and Y. Poovorawan. 2003. Comparative study of different methods to genotype hepatitis C virus type 6 variants. J. Virol. Methods 109:195–201.

7. Chun-Jen Liu; Jia-Horng Kao; Ding-Shinn Chen. Therapeutic Implications of Hepatitis B Virus Genotypes.Liver International. 2005;25(6):1097-1107.

8. Daniele Prati et al. Updated Definitions of Healthy Ranges for Serum Alanine Aminotransferase Levels. Annals of Internal Medicine. July 2002. 137(1):1-10

9. EASL Consensus Conference on Hepatitis B. J Hepatol 2003; 39: S3-25

10. Ge D, Fellay J, Thompson AJ, et al. Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment -induced viral clearance. Nature 2009;461:399-401.

11. Huy, T. T., Ngoc, T. T., and Abe, K., New complex recombinant genotype of hepatitis B virus identified in Vietnam, J. Virol., 82, 5657, 2008.

12. Huy, T. T., and Abe, K., Molecular epidemiology of hepatitis B and C virus infections in Asia, Pediatr. Int., 46, 223, 2004.

13. Hui Ma,1 Rui-feng Yang1 and Lai Wei. Quantitative serum HBsAg and HBeAg are strong predictors of sustained HBeAg seroconversion to pegylated interferon alfa-2b in HBeAg-positive patients. Journal of Gastroenterology and Hepatology 25 (2010) 1498–1506

14. Jane N Zuckerman. Hepatitis virus. Infectious diseases. 2010. 3rd  edition: 1539-1549

15. Kalinina, T., et al., Selection of a secretion-incompetent mutant in the serum of a patient with severe hepatitis B, Gastroenterology, 125, 1077, 2003.

16. Kalinina, T., et al., Deficiency in virion secretion and decreased stability of the hepatitis B virus immune escape mutant G145R, Hepatology, 38, 1274, 2003.

17. Karsten Wursthorn, Marc Lutgehetmann, et al. Peginterferon Alpha-2b Plus Adefovir Induce Strong cccDNA Decline and HBsAg Reduction in Patients With Chronic Hepatitis B. HEPATOLOGY 2006, Vol. 44, No.3,675-684

18. Kenji Abe, et al. Pre-S2 deletion mutants of hepatitis B virus could have an important role in hepatocarcinogenesis in Asian children. Cancer Sci. December 2009; vol. 100; no. 12: 2249–2254

19. Kidd-Ljunggren K, Oberg M, Kidd AH. Hepatitis B virus X gene 1751 to 1764 mutations: implications for HBeAg status and disease. J Gen Virol 1997;78:1469–1478.

20. Kramvis, A., and Kew, M. C. The core promoter of hepatitis B virus, J. Viral Hepat. 1999; 6; 415,

21. Kurosaki M, Enomoto N, Asahina Y, Sakuma I, Ikeda T, Tozuka S, et al. Mutations in the core promoter region of hepatitis B virus in patients with chronic hepatitis B. J Med Virol 1996;49:115–123.

 http://biomedia.vn/